PRÁCTICA 6

18/10/19
PRÁCTICA 6: "TINCIONES ESTRUCTURALES"

TINCIÓN DE ESPORAS

• Las esporas son formas de resistencia producidas por algunas bacterias (Bacillus y Clostridium).
• Presentan una pared impermeable que dificulta su tinción.
• Mediante el calor (que actúa como mordiente) se fuerza la coloración de manera que una vez teñidas, se decolora toda la bacteria pero no lo hace la espora.
• Para llevar a cabo esta tinción se necesitan cultivos de 48 horas como mínimo.

MATERIAL NECESARIO

• Portaobjetos
• Mechero Bunsen
• Pinzas para tubos de ensayo
• Agua destilada
• Muestras bacterianas: B.Megaterium y S.Aureus.
• Asas de platino
• Algodón y alcohol
• Colorantes: Verde de Malaquita y Safranina
• Microscopio y aceite de inmersión                                                                                   
  

TINCIÓN DE WIRTZ

• La más utilizada en microbiología.

• Extensión

1.  Poner una gota de agua destilada en un portaobjetos limpio y desengrasado con el asa de platino previamente flameada y fría.
2. Flamear el asa y el mango.
   
   
   
3. Agitar suavemente el asa para enfriarla.
4. Coger la placa de Petri que contiene las colonias de B.Megaterium y dar unos golpecitos suaves en el borde interior lateral de la placa de Petri para asegurarnos de que esté bien fría el asa y tocar brevemente sobre una colonia aislada de esta muestra bacteriana.
   
5. Cerrar la placa de Petri (la cual debemos situar siempre boca abajo para evitar que en el caso de que se forme vapor de agua caiga sobre los microorganismos).
6. Coger el portaobjetos con la gota de agua destilada y extender y homogeneizar la suspensión.
   
7. Flamear el asa y situarla en la gradilla. 
   • Desecación
8. Coger el porta con las pinzas para tubos de ensayo y situarlo en la parte alta de la llama para que se seque. 
   
   • Fijación
9. Una vez seca la suspensión, proceder a la fijación pasando el porta unas 3 veces por la llama del mechero Bunsen.
   • Tinción
10. Colocar todos los portaobjetos sobre unas barras de metal sobre el fregadero y cubrir las preparaciones con Verde Malaquita 1 minuto en frío.
    
    
    
    
    
    
    
11. Posteriormente, calentar, con un asa de platino envuelta en algodón empapado en alcohol y prendido con un encendedor, hasta la emisión de vapores. Mantener caliente durante 5 minutos.
    
    
    
    
    
    
12. Lavar la preparación bajo el grifo con agua.
    
13. Colocar el porta sobre barras paralelas en una cubeta de tinción y teñir la preparación con Safranina durante 1 minuto.
    
    
    
14. Lavar con agua destilada.
15. Dejar secar a Tª ambiente.
    
16. Observar al microscopio (las esporas se ven de color verde).                                                        
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    NOTA:
    Realizar el mismo procedimiento con S.Aureus.
    

 24/10/19
TINCIÓN DE CÁPSULAS. MÉTODO DE ANTHONY
Necesita un cultivo de 24 horas. Bacillus sp (B.Megaterium)

PROCEDIMIENTO:

1. Extensión, Desecación, NO FIJACIÓN.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
2. Cristal violeta durante 1 minuto.
3. Lavar con solución saturada de sulfato de cobre al 20% para aumentar la refringencia de la cápsula.
   
4. Secar al aire y observar con 100x.
   

          RESULTADO:
      La cápsula se observa como un halo transparente ligeramente azulado alrededor de la bacteria que se tiñe de violeta.

TINCIÓN DE CÁPSULAS. TINCIÓN DE BURRI O DE LA TINTA CHINA O TINCIÓN NEGATIVA

TÉCNICA
- Extensión, Desecación, NO FIJACIÓN.

- Coloración con fucsina diluida 2 minutos.

- Lavar con agua destilada.
- Secar al aire.
- Colocar de 2-3 gotas de nigrosina al 1% en un extremo del porta con el frotis y extenderlas por el método de la cuña (dos portaobjetos):
Este método consiste en colocar un portaobjetos formando un ángulo de unos 45º sobre la preparación bacteriana preparada previamente; se hace contacto con la gota llevándolo hacia atrás, la nigrosina alcanza por capilaridad todo el ancho del porta. Es aconsejable que la nigrosina no llegue a los lados del porta sobre el que se realizará la extensión.
Se arrastrará con movimiento uniforme y a una velocidad media por todo el porta donde se depositó la negrosina. El deslizamiento debe acabar a 1cm del extremo final con un movimiento de ascensión del porta extensor.
La extensión debe ser cada vez más delgada y terminar antes de llegar al extremo opuesto del porta.

  - Secar y observar en el objetivo de inmersión.
RESULTADO
Sobre un fondo negro se observan los microorganismos teñidos de rojo y la cápsula como un halo blanco que los rodea.