PRÁCTICA 5

17/10/19
PRÁCTICA 5: "TINCIÓN DE GRAM"

OBJETIVO
Diferenciar las bacterias en Gram (+) y Gram (-) en función de la distinta composición de su pared bacteriana.

COLORACIÓN DE GRAM

• Hans Christian Joachim Gram (1853-1938).
• Bacteriólogo Danes que desarrolló un método para teñir Bacterias en el año 1884.                       
  

MATERIAL NECESARIO

• Mechero Bunsen
• 3 portaobjetos por grupo
• Solución salina fisiológica (SSF)
• Asas de platino
• Muestras de cultivo bacteriano (Bacilus Subtitulis, Fytobacter y Proteus).
• Pinzas para tubo de ensayo
• Gradilla
• Colorantes de Gram [cristal violeta (colorante primario), lugol (mordiente:acentúa la penetración del colorante primario), decolorante (alcohol-acetona), safranina (colorante de contraste: tiñe las bacterias decoloradas G(-)]
• Barras paralelas
• Frasco lavador con agua destilada
• Microscopio  
  

PROCEDIMIENTO

• TINCIÓN DE GRAM: "PROTEUS"

• Extensión

1. En primer lugar, colocamos en un portaobjetos limpio, seco y desengrasado, una gota de SSF estéril.
   
2. Flamear el asa de platino (como ya hemos explicado en prácticas anteriores) y posteriormente el mango.
   
3. Enfriar agitándola suavemente.
4. Coger con la mano izquierda el tubo de vidrio con Proteus (previamente situado en la gradilla juntos con las asas de siembra), quitarle el tapón de rosca con los dedos anular y meñique de la mano derecha (con la que mantenemos el asa de siembra).   
   
                                                            
5. Flamear la boca del tubo de vidrio realizando 3 o 4 pases con el tubo por la llama del mechero.
6. Introducir el asa en el tubo de vidrio que contiene el agar sólido con colonias de Proteus. Primero debemos tocar las paredes situadas en la parte superior del tubo para asegurarnos de que el asa esté fría y posteriormente tocaremos de manera breve sobre una colonia aislada o bien pasaremos el asa ligeramente sobre la superficie del medio de cultivo.
   
   
   
7. Flamear de nuevo la boca del tubo y posteriormente lo cerramos con su correspondiente tapón de rosca que hemos mantenido todo el tiempo en la mano derecha entre los dedos meñique y anular.
8. Lo situamos en la gradilla.
9. Cogemos el portaobjetos con la gota de SSF con la mano izquierda y mezclamos la pequeña muestra de Proteus que hemos cogido con el asa con ésta; homogeneizamos y extendemos bien.
   
10. Flamear el asa y colocarla en la gradilla.
    • Desecación
11. Coger el portaobjetos con las pinzas para tubos de ensayo y colocarlo en la parte alta de la llama hasta que quede completamente seco. (Hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta, pues las células pueden deformarse o romperse).
    
    
    
    • Fijación por calor
12. Pasar el porta 3 veces por la llama del mechero. (Se debe tener cuidado de no calentar mucho el portaobjetos). 
    
    
    
    • Coloración
13. La extensión, ya fijada, se sitúa sobre las barras paralelas colocadas en la cubeta de tinción y se procede a realizar la tinción de Gram.

1. Cubrir la preparación con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
   • Lavar con agua destilada ligeramente.
2. Lugol (mordiente que acentúa la penetración del colorante primario) durante 1 minuto.
   • Lavar con agua destilada ligeramente.
3. Decoloración con alcohol-acetona (15 a 20 segundos). Este reactivo solo arrastra el colorante en las bacterias G(-).
   - Se puede hacer sobre las paralelas o sosteniendo el porta entre los dedos pulgar e índice y decolorando hasta un ligero tinte azul. Pero en este caso, lo hemos realizado sobre las paralelas.
   - La decoloración es la parte más complicada de la tinción de Gram ya que si se fuerza el tiempo se pueden obtener resultados erróneos.
   Lavar con abundante agua para que no queden restos de alcohol.
4. Colorante de contraste: Cubrir con Safranina (1 minuto y 30 segundos) o fucsina diluida (más tiempo), la cual tiñe de rojo a las bacterias decoloradas, es decir las G (-) que tienen una pared celular fina. En este caso se ha utilizado Safranina. 
   

• Lavar con abundante agua.
• Dejar secar el porta a Tª ambiente.
• Observar al microscopio óptico con el objetivo de 100x. Antes debemos enfocar con el objetivo de 40x.
  En mi grupo no nos ha dado tiempo a visualizar las preparaciones al microscopio, pero debería observarse lo siguiente:  
  
  
  

• TINCIÓN DE GRAM:"BACILLUS SUBTITULIS"

Se sigue el mismo procedimiento explicado anteriormente pero en este caso las colonias de Bacilus Subtitulis se encuentran en una placa de Petri, por lo que debemos tocar en una colonia aislada con el asa de platino previamente flameada para coger una pequeña cantidad de esta muestra bacteriana.
No nos ha dado tiempo tampoco a visualizarlos, pero debería verse de la siguiente forma:

• TINCIÓN DE GRAM: "FYTOBACTER"

Se realiza de la misma manera que la tinción de Gram con Bacilus Subtitulis.                                       

PRECAUCIONES

• Extensión: Es importante que la preparación sea fina:
  - Si se pone demasiada muestra, el frotis quedará muy grueso (se observará una gran mancha coloreada). En el microscopio, con el objetivo de inmersión, se observará una masa oscura de estructuras que no pueden distinguirse de forma individual y por tanto se dificulta el proceso de observación e identificación.
• Fijación: Si la extensión bacteriana no se fija adecuadamente, las bacterias se pierden durante los sucesivos lavados y solo se observará la ausencia de bacterias teñidas.
• Por el contrario, un sobrecalentamiento del porta, durante esta fase, puede ocasionar la aparición de artefactos y la ruptura de la morfología de las células bacterianas.
• Antes de colocar el porta en la platina del microscopio se debe marcar la cara en la que está depositada la muestra.
• Al microscopio, se deben observar varios campos hasta encontrar uno en donde las células estén adecuadamente separadas, para permitir la visualización de la morfología, de las agrupaciones celulares, la presencia de endosporas y su comportamiento frente a los colorantes de Gram.