PRÁCTICA 4

10/10/19
PRÁCTICA 4: "FROTIS Y TINCIONES SIMPLES"

OBJETIVOS

1. Realizar extensiones o frotis bacterianos a partir de muestras sólidas y líquidas.
2. Realizar una tinción simple de las bacterias y levaduras presentes en distintas muestras naturales.
3. Observar la morfología bacteriana y comenzar a distinguir los diferentes tipos de agrupaciones existentes.
4. Practicar con el microscopio empleando el máximo aumento, aplicando correctamente el aceite de inmersión y regulando adecuadamente el condensador y el diafragma.

FUNDAMENTO

1. El yogur es un producto lácteo producido por la fermentación natural de la leche. A nivel industrial la fermentación se realiza añadiendo a la leche una mezcla (3-4%) de Streptococcus termophilus, que produce poco ácido, pero es muy aromático y Lactobacillus bulgaricus, que es muy acidilicante.
2. Las levaduras son hongos microscópicos unicelulares. En la industria son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias como: pan, vino, cerveza (Saccharomyces cerevisiae), etc.
3. El sarro dental es un depósito consistente y adherente, formado por restos proteicos, sales minerales y bacterias que se localiza sobre el esmalte de los dientes. En la cavidad bucal abundan bacterias saprófitas, pudiéndose observar gran variedad de morfologías: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.

MATERIAL NECESARIO

• 3 asas de platino (una para cada componente del grupo)
• Gradilla
• Bote de agua destilada o Solución Salina Fisiológica (SSF)
• Mechero Bunsen y encendedor
• 3 portaobjetos por persona
• Muestras bacterianas de origen natural (yogur, sarro dental y levadura de cerveza)
• 2 pinzas para tubo de ensayo
• Colorantes para tinción (cristal violeta, safranina, azul de metileno)
• Microscopio y aceite de inmersión
• Hisopo estéril  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  

PROCEDIMIENTO

• BACTERIAS DEL YOGOURT

• Extensión

1. Sobre un portaobjetos desengrasado y limpio, depositamos una gota de solución salina fisiológica o agua destilada, con el asa previamente flameada.                                                       
   
    
   
   
   
   
2. Flamear el asa de platino formando un ángulo de 60º en vertical con la llama oxigenada del mechero Bunsen y levantándola de manera que quede al rojo vivo. Seguidamente, flamear también el mango del asa.     
   
   
3. Enfriar agitando el asa suavemente.
4. Tocar un poco sobre las paredes situadas en la parte superior del yogourt para asegurarnos de que el asa esté fría e introducir el asa en el yogourt dando unos toquecitos en posición vertical.   
   
   
   
   
5. Con la mano izquierda coger el portaobjetos y remover lo que hayamos recogido con el asa de la muestra de yogourt con la gota de SSF, que anteriormente habíamos colocado en el portaobjetos, hasta formar una suspensión homogénea y extenderla bien realizando movimientos ovalados con el porta situado en posición horizontal.
   (Nota 1: Si se trata de un cultivo en medio líquido, no es necesario colocar la gota de SSF, basta con realizar directamente la extensión)
   (Nota 2: Todo ello en las proximidades del mechero Bunsen, 15-20 cm, para guardar las condiciones de asepsia - Zona de trabajo).                                                                                        
   
   
   
   
   
   
   
6. Flamear el asa y colocarla en la gradilla.
   • Desecación
7. Coger el portaobjetos con una de las pinzas para éstos, y situarlo ligeramente por la parte alta de la llama (como es el caso) o bien, puede secarse a temperatura ambiente.
   (Precaución: No calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse).
   
   
   
   
                                                                      
   
   
   
   • Fijación por calor (Nota nº4)
8. Una vez seca la homogeneización pasar el porta 3 veces, también con las pinzas, sobre la llama azul del mechero (de tal forma que quede caliente al dorso de la mano pero sin que queme) y dejando enfriar, pues si le añadimos el colorante precipitaría por el calor.
   • Tinción
9. Situar el portaobjetos sobre un soporte (barras paralelas) en una cubeta de tinción y depositar sobre la extensión, cristal violeta (1 minuto) o safranina (1 minuto y 30 segundos) durante 1-2 minutos. 
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
10. Lavar con agua destilada.
    
11. Dejar secar la extensión a Tª ambiente.
    • Observación al microscopio
12. Observar con los objetivos de 40X y de 100X. Para visualizar la preparación con éste último objetivo, debemos poner una pequeña gota de aceite de inmersión. 
    
    
    
    
                                  Streptococcus termophilus en agrupación de cadenas
    
    
                                                          Lactobacillus bulgaricus

• LEVADURAS

Se realiza el mismo procedimiento que ya hemos explicado anteriormente, pero en vez de coger una muestra de yogourt, en este caso, cogeremos levadura de cerveza:

1.  Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, depositamos una gota de solución salina fisiológica.
2. Flamear el asa de platino formando un ángulo de 60º en vertical con la llama oxigenada del mechero Bunsen y levantándola de manera que quede al rojo vivo. Seguidamente, flamear también el mango del asa.
3. Enfriar agitando el asa suavemente.
4. Coger una pequeña cantidad de levaduras de cerveza.                                                                  
   
5. Con la mano izquierda coger el portaobjetos y remover lo que hayamos recogido con el asa de la muestra de levaduras con la gota de SSF, que anteriormente habíamos colocado en el portaobjetos, hasta formar una suspensión homogénea y extenderla bien realizando movimientos ovalados con el porta situado en posición horizontal.
6. Flamear el asa y colocarla en la gradilla.
7. Coger el portaobjetos con una de las pinzas para éstos, y situarlo ligeramente por la parte alta de la llama (como es el caso) o bien, puede secarse a temperatura ambiente.
8. Una vez seca la homogeneización pasar el porta 3 veces, también con las pinzas, sobre la llama azul del mechero (de tal forma que quede caliente al dorso de la mano pero sin que queme) y dejando enfriar, pues si le añadimos el colorante precipitaría por el calor.
9. Situar el portaobjetos sobre un soporte (barras paralelas) en una cubeta de tinción y depositar sobre la extensión, cristal violeta (1 minuto) o safranina (1 minuto y 30 segundos) durante 1-2 minutos.
10. Lavar con agua destilada.
11. Dejar secar la extensión a Tª ambiente.                                                                                           
    
    
    
    
12. Observar con los objetivos de 40X y de 100X. Para visualizar la preparación con éste último objetivo, debemos poner una pequeña gota de aceite de inmersión.                                               
    
                                                        Saccharomyces cerevisiae

• BACTERIAS DEL SARRO DENTAL
  • Extensión

1. Con un asa de siembra, previamente flameada, se deposita una gota de agua estéril sobre un portaobjetos limpio y desengrasado.
2. Flamear el asa de nuevo.
3. Con un hisopo estéril tomar una pequeña proporción de sarro dental; suspenderlo y homogeneizarlo en la gota de agua.
   • Desecación
4. Coger el porta con las pinzas, y ponerlo ligeramente por la parte alta de la llama, teniendo mucha precaución de no calentar demasiado el portaobjetos debido a que las células pueden deformarse o romperse.
   • Fijación por calor
5. Con el porta, realizar 3 pases por la llama azul del mechero Bunsen y lo dejamos enfriar.
   • Tinción
6. Colocar el porta sobre el soporte situado encima de la cubeta de tinción y depositar sobre él Safranina (1 minuto y 30 segundos) o Cristal violeta (1 minuto) durante 1-2 minutos.
7. Lavar con agua destilada.
8. Dejar secar a Tª ambiente la preparación.
   • Observación al microscopio
9. Observar con 100x, poniendo una pequeña gota de aceite de inmersión. Antes, es recomendable enfocar con el objetivo de 40x.                                                                                 
   

NOTAS

• Nº1: Cuanta más cantidad de agua destilada o solución salina fisiológica, más tardará luego la extensión en secarse.
• Nº2: Cuanta más cantidad de muestra le pongamos a la gota de agua destilada o SSF, se podrá apreciar menos la morfología bacteriana, al haber un exceso de muestra.
• Nº3: En microbiología, no se usan fijadores para la fijación de las preparaciones en portas, sino que el método más habitual y frecuente, es la fijación por calor, no por fijadores.
• Nº4: Objetivos de la fijación: Adherir el frotis al vidrio del portaobjetos, para que la muestra no sea arrastrada con los lavados que se realizan durante la tinción y para hacer que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio, sin alterar la morfología ni las agrupaciones bacteriana que pudiera haber.
• Nº5: Es recomendable, a la hora de visualizar a través del microscopio las preparaciones, realizar la observación con el diafragma cerrado y el condensador alto del microscopio óptico.
• Nº6: Rotular por la cara contraria del portaobjetos en la que hemos realizado la preparación de la muestra a observar, para evitar que durante la tinción se borre el rotulado.