PRÁCTICA 7

12/11/19
PRÁCTICA Nº 7: "PRUEBAS BIOQUÍMICAS"

 MATERIAL NECESARIO
  • Mechero Bunsen.
  • Gradilla.
  • 2 tubos con medios líquidos o semilíquidos de LFC.
  • 2 medios sólidos en placas de Petri: Mannitol Salt Agar y DNASA DNASA AGAR.
  • Cultivo de S.aureus.
  • 2 portaobjetos.
  • Asas de siembra estériles de plástico desechables.
  • Agua oxigenada.
  • Vaselina líquida.
  • Tapones para tubos de ensayo.
  • Plasma citratado en tubo eppendorf.
  • Pipeta automática de 100-1000 microlitros y puntas de pipeta azules.
  • Pinzas metálicas.
  • Discos de novobiocina. 
A. CATALASA
- Introducción:
La catalasa es una enzima, propia de las bacterias anaerobias facultativas, que descompone el peróxido de hidrógeno (H202) en agua y oxígeno, que se desprende en forma de burbujas:
2 H202 --> 2 H2O  + 02
De esta manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H202, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares.
Se utiliza para diferenciar el género Staphylococcus y Micrococcus (catalasa +) del género Streptococcus (catalasa -).
- Procedimiento:
  1. Sobre un portaobjetos, se deposita una colonia de 24 h. de Aureus.
  2. Se añade una gota de agua oxigenada al 3%.
    Nota: sin invertir el orden y sin mezclar con el asa.
- Resultado:
Ha habido desprendimiento de burbujas (prueba +), por lo que se trata de un Staphylococcus o Micrococcus. Como en nuestro caso hemos empleado el Staphylococcus Aureus, el resultado ha salido correctamente.
- Observaciones:
  •  Las colonias se deben tomar de un medio sin sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden falsear los resultados.
  • Esta prueba también puede realizarse en tubo.

 B.OXIDO-FERMENTACIÓN
- Introducción:
  • Estudia la capacidad de los microorganismos para oxidar y/o fermentar la glucosa produciendo ácido, que se detecta por la presencia de un indicador de pH (azul de bromotimol), que vira de color verde a amarillo.
  • Diferencia cocos Gram (+) entre sí.
  • También diferencia Pseudomonas y Enterobacterias de otros bacilos Gram (-).
- Procedimiento:
  1. Se siembra la muestra, en picadura, en dos tubos que contienen el medio de Hugh Leifson (O/F) adicionado de un 1% de glucosa.
  2. Añadir vaselina líquida estéril a uno de los tubos para conseguir anaerobiosis.
  3. Se incuban a 37ºC durante 24-48 horas.
- Resultado:
A la mayoría de los grupos no nos ha salido el resultado adecuado, debido a que posiblemente los microorganismos estén viejos.
Resultado erróneo: En nuestro caso nos ha salido +/-  (oxidativo), aunque no es el resultado muy claro.

 Resultado correcto-->  (+/+) fermentativo:

C. FERMENTACIÓN DEL MANITOL
- Introducción:
  • Estudia la capacidad de los microorganismos para fermentar el manitol y crecer en presencia de una elevada concentración de NaCl (Medio de Chapman).
  • Cuando el microorganismo fermenta el manitol se producen metabolitos ácidos que cambian el pH del medio y el indicador (rojo fenol) vira a amarillo.
  • Diferencia S.aureus del resto de los estafilococos.
- Procedimiento:
  1. Coger un asa de siembra de plástico desechable.
  2. Tocar brevemente sobre una colonia aislada de S.aureus.
  3. Coger la placa de Petri que contiene el medio de Manitol y sembrar el microorganismo mediante la técnica de agotamiento de estrias.

  4. Tapar la placa de Petri.
  5. Flamear el asa de plástico desechable con ayuda del mechero y tirarla al contenedor de desechos.
- Resultado:
No nos ha salido el resultado adecuado, ya que la fermentación del manitol debería haber sido positiva con el consiguiente cambio de color del medio a amarillo (S.aureus), pero no se ha apreciado este cambio de color.

 D. DNAsa
- Introducción:
  • Estudia la capacidad que tienen algunas bacterias para producir el enzima DNAsa, que produce la degradación del DNA que contiene el medio de cultivo.
  • Diferencia las especies patógenas de Staphylococcus (DNAsa +) de las no patógenas (DNAsa -).
  • Otros géneros como Serratia y Bacillus también dan positiva esta prueba.
- Procedimiento:
  1. Tocar brevemente sobre una colonia aislada de S.aureus con el asa de siembra de plástico desechable.
  2. En una placa que contiene Agar DNAsa, se siembra la muestra, haciendo una estría vertical de unos 2 cm.
  3. A continuación, se realizan una serie de estrías horizontales de diámetro muy pequeño y muy juntas sobre la estría vertical.
  4. Flamear el asa de siembra y desecharla.
  5. Incubar la placa durante 24 h. a 37ºC.
  6. Una vez incubada la placa, se procede a la lectura de los resultados.
- Resultados:
La lectura se hace añadiendo ácido HCl 1N (que precipita el DNA) y observando la aparición de zonas claras alrededor de la zona sembrada.

Al tratarse de un Staphylococcus Aureus, debería ser DNAsa + con la consiguiente aparición de una zona clara alrededor de la estría vertical de 2 cm.

 E. COAGULASA
- Introducción:
  • Estudia la capacidad del microorganismo para producir el enzima coagulasa que origina la coagulación del plasma humano o de conejo.
  • Diferencia S.aureus (coagulasa +) de los otros Staphylococcus (coagulasa -).
- Procedimiento:
  1. Preparar una gradilla con un tubo de ensayo de 3 mL.
  2. Depositar 0'5 ml (=500 microlitros) de plasma citratado con ayuda de una pipeta de 100-1000 microlitros y puntas azules.


  3. Sembrar S.aureus con el asa de siembra de plástico desechable por el método de picadura y cerrar el tubo con un tapón.
  4. Se incuba el tubo a 37ºC.
  5. Los resultados estarían listos una vez pasadas 4 horas (observación de la formación del coágulo).
  6. Si es negativo se reincuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18-24 horas.
- Resultado:
Prueba positiva: se observa la formación de un coágulo total o parcial.

F. SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
- Introducción:
  • Algunas especies del género Staphylococcus son resistentes a la novobiocina.
  • Diferencia S. saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa negativos.
- Procedimiento:
  1. Siembra en masa de Aureus en placa de TSA.
  2. Flamear el asa de siembra de plástico desechable y tirarla al contenedor de desechos.
  3. Flamear unas pinzas metálicas y agitarlas dentro de un diámetro de 15-20 cm del mechero Bunsen (zona estéril) para enfriarlas.
  4. Coger con ellas un disco de Novobiocina.


  5. Depositarlo en el centro del medio previamente sembrado con S. aureus.
  6. Cerrar la placa (siempre invertida) y flamear de nuevo las pinzas para guardarlas.
  7. Se incuba durante 24h. a 37ºC.
- Resultado:
 Aparición de un halo de inhibición de crecimiento alrededor del disco de Novobiocina: Sensible.



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